专家共识| 高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识-公司新闻

摘要

高通量测序技术在分枝杆菌病领域中的应用日益普及，而在实际应用过程中，临床医师对技术本身及如何合理应用检测结果仍存在很多疑问。本共识针对高通量测序技术临床应用中存在的突出问题，依据公开发表的研究数据和参与专家的应用经验，经众多专家讨论形成，为在分枝杆菌病诊断过程中合理使用高通量测序技术提供参考。

高通量测序（high-throughput sequencing）技术在感染性疾病病原学诊断及常见病原微生物的耐药诊断中优势明显，在分枝杆菌病领域也得到越来越广泛的应用，为疑难分枝杆菌病的诊断、鉴别诊断和耐药诊断提供了循证医学证据。

然而在实际应用过程中，临床医师存在诸多困惑。鉴于此，高通量测序共识专家组针对高通量测序技术临床使用过程中存在的突出问题，撰写了本共识，以期提高该技术的临床应用水平，去伪存真，使这项先进的检验技术得到科学合理的应用。

一、高通量测序技术概况

高通量测序技术泛指二代测序技术和第三代测序技术，目前已有多种用于临床感染性疾病的病原微生物鉴定，尤其是当缺乏诊断线索时，鉴定病原微生物具有显著优势。依据检测策略的不同，其主要分为靶向测序、宏基因组学测序（mNGS）和全基因组测序（WGS）。

分枝杆菌靶向测序技术是先通过靶向捕获分枝杆菌特异基因后再进行高通量测序，主要适用于临床怀疑分枝杆菌感染的患者，既有助于诊断结核病/非结核分枝杆菌（NTM）病，又可以检测耐药基因突变，从而精准指导临床医师用药。

2018 年，WHO 发布的《应用高通量测序技术检测耐药结核病相关基因突变的技术指导原则》重点关注了靶向测序技术用于结核病耐药诊断的功能。mNGS 技术则是直接对标本中所有的核酸进行无偏倚检测和序列分析，相比分枝杆菌靶向测序，mNGS 可检测出种类繁多的微生物，但无法实现对结核分枝杆菌耐药基因的全面检测。

二、高通量测序技术的特点

二代测序技术近年来发展迅猛，具有通量高、速度快的优点，但存在读长较短，不利于后续生物信息学分析的缺点，且 PCR 扩增过程中 DNA 序列碱基的 G-C 偏好性会影响检测的准确性。

第三代测序技术也被称为单分子测序技术，可实现对 DNA/RNA 分子直接测序，且读长较长，一般为几十甚至上百 kb，测序通量高，数据可实时读取分析，速度更快，在临床的应用也越来越多。

大量研究数据表明二代测序技术和第三代测序技术各有所长：二代测序读长短但准确度高；第三代测序读长长但单碱基准确性稍差。临床应用过程中应依据检测的主要目的选择适宜的测序技术。

三、开展高通量测序的临床适应证和送检时机

（一）应用高通量测序检测分枝杆菌的适应证

靶向测序适用于病原学阴性的疑似肺结核、肺外结核、NTM 病的诊断及鉴别诊断，也适用于菌量丰富的临床标本或菌株的耐药基因突变检测，或用于分枝杆菌耐药的诊断。美格医学的 TBseq 检测项目可检测 46 种分枝杆菌分型及 19 种抗结核耐药基因和 7 种抗非结核耐药基因，助力临床精准诊疗！

mNGS 适用于病原学阴性的疑似肺结核、肺外结核、NTM 病及其他病原体感染的诊断及鉴别诊断。

（二）高通量测序检测分枝杆菌病的适宜送检人群及时机

1. 靶向测序检测的适宜送检人群及时机

① 疑似肺结核患者，具有典型的肺部影像学改变伴有或不伴有结核病中毒症状，常规的痰标本抗酸杆菌涂片、培养和 Gene Xpert 等分子生物学检查均报告阴性结果时，或是有些患者增加了支气管肺泡灌洗液检查后仍不能确诊时。

② 疑似结核性胸膜炎患者，鉴于胸腔积液常规结核分枝杆菌检查阳性率低，可考虑尽早送检。

③ 疑似肺外结核患者如结核性脑膜炎、淋巴结结核、骨关节结核、结核性心包炎、肾结核、肠结核等，肺外结核诊断较困难，对应的临床标本中的分枝杆菌含量较低，常规检测灵敏度低，建议及早送检。

④ 复治结核患者，经过正规抗结核治疗但效果不理想，且常规的分子生物学检查均报告阴性结果，建议送检以明确耐药情况。

⑤ 疑似 NTM 病的患者，即多次培养及分子检测结果阴性者，尤其是同期抗酸杆菌涂片检查阳性的患者，建议送检。

⑥ 考虑为多种药物耐药的结核病或 NTM 病患者，建议及时送检以进一步获取多种药物的耐药证据，此时推荐送检菌量丰富的临床标本或菌株。

2. mNGS 检测的适宜送检人群及时机

① 疑似肺结核、结核性胸膜炎患者，常规的分子生物学检查均报告阴性结果，但仍需考虑与其他感染性疾病相鉴别的患者，建议送检。

② 脑脊液常规检查及生物化学检查符合结核性脑膜炎的特点，脑脊液常规的分子生物学检查均报告阴性结果，且患者无法排除其他感染，建议尽早送检。

③ 淋巴结、肺组织、肠黏膜组织等新鲜组织标本病理检查发现肉芽肿性病理改变但未查到结核相关证据，仍需考虑与其他疾病鉴别时，建议送检组织标本。

四、标本的采集、检测、报告及实验室质量控制

临床标本的质量直接影响检测结果。不同标本类型受定植菌影响的程度不同，建议建立不同类型临床标本的标准操作程序，减少污染的可能。

（一）知情同意

标本采集前主管医师应向患者或其监护人或者委托人告知拟开展检测项目的目的、意义、优点和局限性、费用等。在整个流程中，要注意保护患方的个人隐私。

（二）标本采集

针对分枝杆菌患者感染部位的不同，采集的标本类型主要包括痰液、诱导痰、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、脑脊液、尿液、活检新鲜组织、血液等。（详情见原文）

（三）标本保存和运输

标本采集后，应尽快送检，建议用冰袋低温运输。若运输时间在 24~72h 内，建议干冰运输。若无法及时送检，血液标本可置于 4℃ 冰箱保存，但最长保存时间不得超过 7d。

（四）高通量测序技术检测的操作流程

1. 样本前处理

分枝杆菌病患者的标本具有潜在的感染性，在样本处理前需进行灭活处理。通常样本前处理主要涉及分装、研磨、破壁、离心、过滤和纯化等步骤，分枝杆菌细胞壁较厚且含有大量脂质，因此需要进行破壁处理。

2. 核酸的提取

核酸提取的质量是决定高通量序检测成功的关键，不同的操作实验室都应建立完整的核酸提取流程。

3. 文库构建和基因测序

文库制备实验流程包括 PCR 富集、添加接头、末端修复、连接接头、纯化等流程，文库质量直接影响测序的数据质量。

目前，主流测序平台包括二代测序平台和第三代测序平台，二代测序的数据量至少为 2000 万条（20 million，即 20M）高质量序列，第三代纳米孔的数据量至少为 50000 条高质量序列。

４. 生物信息学分析

该流程由多个软件组成，包括去除人源序列、处理微生物序列及相关元数据、检测目标序列，以及特定基因变异，实现检测与数据的转换。

5. 质量控制

实验室在各个操作环节都应进行严格的质量控制。每批次样本中应设置包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。每批次实验均需评估是否存在操作或环境带来的污染风险。

（五）出具报告

病原体检测报告需要符合《医疗机构临床实验室管理办法》与《医学检验实验室基本标准和管理规范（试行）》对检测报告的要求。检测报告需要有严格的发放和审核流程，以确保报告的及时性、有效性、准确性和完整性。

五、临床结果判读

分枝杆菌病的诊断需结合流行病学史、临床表现、影像学和实验室检查结果等综合判断。

阳性结果解读需要关注：是否是常见的致病菌，临床表现是否与其致病性一致，是否能与其他病原学结果相呼应。阴性结果具有一定排除感染的价值，但还需结合临床进行综合判断。

（一）结核病诊断

1. 不同标本类型的诊断价值

临床所有类型的标本均可开展高通量测序检测，但不同类型标本由于其自身特点的不同，由其衍生出的高通量测序数据的诊断价值会存在差异。（详情见原文）

2. 阳性阈值及判读标准

建立高通量测序病原体诊断阈值的影响因素较多，包括测序平台、测序流程、标本类型、病原体种类、患者状况，目前尚无统一公认的阈值。

① mNGS 阳性阈值设定原则及判读标准：《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》建议，结核分枝杆菌检出 1 条特异性序列即可判定为阳性。鉴于检测的复杂性，本共识建议对获得个位数的序列需先审核当前批次检测中有无其他获得大量序列支持结核病诊断的标本。

② 靶向测序阳性阈值设定原则及判断标准：特异性序列大于 100 条序列，且非单一靶点序列，可推荐作为阳性阈值判定标准；特异性数据小于 100 条序列，特别是同批次有获得大量序列数支持结核病诊断的标本时，需行其他方法学进行佐证，可进行实时荧光定量 PCR 确认。特异性数据小于 10 条序列时，尤当慎重判读，建议考虑另留取一份样本进行检测以佐证本次检测结果。

如重复样本获得阳性结果，无论序列数如何，都应首先考虑其结核病诊断；如果复测结果为阴性，则暂不考虑其结核病诊断。

（二）NTM 病诊断

高通量测序检测到 NTM 与结核分枝杆菌的核酸存在明显不同的价值，这种不同主要是因为 NTM 并非像结核分枝杆菌一样属于绝对致病菌。

除了海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌外，NTM 都属于机会致病菌，可在机体中定植而不引起疾病，因此需要依照指南推荐的判断标准，仔细辨别其是否是引起感染的病原菌。

1. 高通量测序检测结果回报为常见的致病性 NTM 菌种

我国常见的 NTM 菌种中，临床相关性较好的有胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，其次是鸟分枝杆菌。高通量测序检测阳性等同于 1 次分子检测阳性，因此需要至少再有 1 份标本的检测鉴定结果为同一菌种时才可考虑其临床意义。（详情见原文）

（三）分枝杆菌病的耐药诊断

1. 高通量测序技术对耐药分枝杆菌病的诊断价值

mNGS 技术通常无法获得足够的结核分枝杆菌/NTM 的核酸序列信息，因此不用于分枝杆菌耐药的诊断。

靶向测序通过特定的捕获技术对标本中结核分枝杆菌/NTM 核酸及耐药基因进行富集，以提高核酸浓度，获得更多的数据信息。当临床标本中菌含量丰富时，能捕获到数量较多的不同耐药基因的序列，从而进行耐药的分子诊断。

2. 耐药基因阳性阈值及判断标准

目前针对临床标本靶向测序检测分枝杆菌耐药的判定缺乏统一的标准。在判读时，应参考突变发生位点、测序深度及突变频率综合判断。

六、结语