传统的无菌标本的培养是病原诊断的“金标准”[1,2]，但其诊断的敏感性远不能达到临床病原诊断的需求。宏基因组新一代测序技术（mNGS）相比较传统方法，具有快速，灵敏度高的优势，可以同时检测出一大群差异极大的微生物类群，尤其可以无差别的检测出已知或未知病原和耐药性基因信息[3,4]，显著提升临床病原诊疗效能。有学者预测在未来10年内，宏基因组测序将作为常规检测手段应用于对病原体诊疗方面[5]。
在上篇中，我们已经详细介绍了“宏基因组学发展简史”和mNGS检测前注意事项，在本篇，我们将接着介绍mNGS检测后的注意事项。
mNGS检测后注意事项
一、mNGS检测影响因素[6]
1. 病原体基因组大小
2. 病原体生物结构
3. 样本人源占比
二、mNGS报告解读
1. 微生物菌种类型
明确的致病菌（低序列也需要临床考虑）：
结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、军团菌、诺卡菌、流感病毒、新冠病毒、曲霉、新型隐球菌、马尔尼菲蓝状菌、组织胞浆菌、腺病毒、耶氏肺孢子菌、鹦鹉热衣原体、肺炎支原体、呼吸道合胞病毒等等。
条件致病菌（结合标本类型、序列数、微生物排名、动态变化及临床诊断综合判断）：
铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、念珠菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽假单胞菌等等[6]。
常见的定植菌：
（1）呼吸道：丙酸杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属、莫拉菌属、韦荣球菌属、链球菌属、嗜血杆菌属、梭杆菌属、奈瑟菌属、普雷沃菌、假单胞菌属、卟啉单胞菌属等；
（2）皮肤：结核硬脂酸棒状杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿棒状杆菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、人葡萄球菌、非发酵棒状杆菌、缓症链球菌、球形马拉色菌、限制马拉色菌、合轴马拉色菌、塔宾曲霉等。
2. 阳性标准（仅供参考）
脑脊液样本：
（1）对于细菌、真菌与寄生虫，RPM（指每百万序列的特异性读长比率，RPM=RPM 脑脊液/RPM 非模板对照）≥10，判断为阳性；
（2）对于病毒（DNA或RNA病毒），检出读长应至少覆盖全基因组的 3 个非重叠区域，判断为阳性[7]。
呼吸道样本：
（1）细菌（分枝杆菌除外）、真菌、病毒：病原种类的相对丰度>30%，或某一病原培养阳性且mNGS序列数>50；
（2）结核分枝杆菌：只要有一条序列即可判断阳性；
（3）有临床其他试验（病理、培养、涂片、抗原或抗体检测、PCR）证明某 一微生物阳性时，mNGS鉴定的该微生物被归类为确认病原体；
（4）如果仅有mNGS检测出的传染性病原体，而没有其他任何临床试验验证，则此微生物被认为是潜在的病原体。所有经mNGS鉴定检出但不符合mNGS 阳性结果标准的微生物都被认为是不确定病原体[8-10]。
血液样本：
（1）明确感染（definite）：mNGS检测的病原结果与其他微生物检测方法结果一致（同一样本检测期限为7天）；
（2）临床诊断（probable）：根据临床、放射学或实验室检查结果，测序病原体结果被认为是脓毒症预警的可能原因；
（3）拟诊（possible）：病原结果具有与临床表现一致的潜在致病性，但对症状的另一种解释更有可能；
（4）不大可能（unlikly）：结果与临床表现不一致[11]。
共识（阈值）：
（1）一般细菌：mNGS检测到某种细菌（种水平）的序列数是其余所有细菌的10倍以上，有临床意义；
（2）真菌：mNGS检测到真菌（种水平）的序列数是其余所有真菌的５倍以上，有临床意义；
（3）MTB：为明确致病菌，环境污染的可能小。此外，因MTB为胞内致病菌，细胞外游离DNA 少，且MTB核酸提取效率低，mNGS只要检测到１条属水平的MTB复合群序列，且能排除其他标本携带污染，就有临床意义；
（4）非结核分枝杆菌：可能是环境中污染菌，若检出， 需结合背景微生物库和mNGS原始细菌列表进行结果判读。若排除污染后属水平或种水平序列数排名前十，则有临床意义[12]。
3. 报告解读常见错误
（1）Reads数最大，不一定是致病病原体：
一项在13例耶氏肺孢子（PJP）感染病例中，mNGS检出的病原体reads数排名显示，PJP不都是排名第一，但是确是致病病原体。所以，mNGS检出病原体reads数的大小不一定决定致病的情况[7]。
（2）“被扔掉的数据”，不一定没有用（病例源自微信公众号“呼吸界”）：
因此，在报告解读时，需要注意检出的疑似微生物列表，因为这也可能就是导致病人致病的主要原因。
（3）“不常见”的菌，不一定没有意义（病例源自微信公众号“呼吸界”）：
结论：这个病人为女性同性恋，所以，我们在遇到部位 “不常见” 病原检出时，一定要大胆实践，小心求证。
总结：
（1）mNGS已经越来越多的被临床所熟知，我们临床医生需要对其做好一定的了解，才能更好的利用好这个工具，更好的帮助临床；
（2）mNGS检测前（样本类型及采集等）和检测后（报告解读）是我们临床医生可控部分，尽可能的去遵循“专家共识”，让mNGS检测更有意义；
（3）目前mNGS尚无公认的阳性阈值标准，在一定情况下，我们可以用已发表的文献数据作一定的参考；
（4）感染性疾病病原诊断要以患者为中心，临床起主导作用，最终还是要回到患者本身。所以，面对mNGS技术，我们临床要大胆的实践，小心的求证。
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